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文丨vb动脉网，作者丨曹弦
提及2019年基因测序领域的发展，“单细胞测序”毫无疑问是其中关键词。
2019年9月，美国单细胞测序公司10x Genomics在纳斯达克上市，IPO3.9亿美元，成为该领域的领头羊。国内单细胞测序行业发展较为滞后，但也颇受资本青睐。2019年3月，万乘基因完成五百万元天使轮融资；6月，百奥智汇完成A轮融资，新格元生物完成近亿元pre-A轮融资；10月，寻因生物完成数千万元pre-A轮融资。
单细胞测序即从单个细胞水平上对基因组进行测序，把基因测序应用到单个细胞层面，从而识别细胞的类型、功能，特定细胞健康或状态的变化、变异。而常规的基于NGS的基因检测，都是在大量细胞宏观水平上，对整个细胞群进行遗传分析。
近年来，单细胞测序相关研究与日俱增，截止到2019年，Pubmed中已发表1338篇科学文献。该技术已广泛应用于科研行业神经生物学、种系传播、器官生长、癌症生物学等多个领域的研究。
数据来源：Pubmed、动脉网整理
单细胞测序是单细胞遗传物质分析的重要手段，并不是单细胞研究的全部。放眼全球，单细胞研究已经发展成多组学研究，包括单细胞转录组、基因组、表观组、甲基化、ChlP、蛋白组等，总的来说主要聚焦在两个领域：单细胞遗传物质分析与单细胞蛋白分析。
全球单细胞测序从2009年开始起步，彼时，北京大学汤富酬教授在博士后期间发表了世界第一篇单细胞mRNA测序的文章，引起业界广泛关注。2012年，美国单细胞高通量测序公司10x Genomics、Mission Bio相继成立。国内单细胞测序技术的应用从2014年起步，但大都集中在低通量领域，应用局限于应用为胚胎植入前遗传学检测（PGD），外周循环肿瘤细胞（CTC）等。
单细胞测序（SCS）发展历程：
（图片来源：Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies、动脉网绘制）
在高通量测序领域，以试剂盒、微流控设备研发为核心的企业如寻因生物（2015年）、微著生物（2017年）、新格元生物（2018年）、万乘基因（2018年）等通过自主研发核心技术微流控，将单细胞测序从实验室走到市场，并完成早期融资；以单细胞生信分析为主的代表企业百奥智汇（2018年）也完成了IDG资本的A轮融资。
在基因层面，单细胞测序可以获取更精准的遗传信息，在蛋白层面，通过分析单细胞表达的蛋白可以直接的获取人体免疫相关的靶点，用于免疫诊断、新药研发等。鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，单细胞蛋白分析的常见、有效技术是质谱分析，主要技术包括质谱流式细胞术（Mass Cytometry）、TOF-SIMS（飞行时间二次离子质谱仪）分析等。
质谱流式技术平台最初由美国DVS Science开发，但这家企业于2014年被美国Fluidigm以2.1亿美元收购。国内单细胞蛋白分析的代表企业为宸安生物、普罗亭，其中，宸安生物专注单细胞质谱流式诊断设备、试剂和软件开发，普罗亭致力于以单细胞蛋白层面研究为核心的检测服务。
无论是基因层面，还是蛋白层面，单细胞分析技术已然成熟，但囿于成本并未广泛应用于市场上，更多的是为科研提供服务。动脉网整理了全球单细胞行业的目前发展状况，以及单细胞技术在赢来大规模应用之前面临的挑战与机遇。
核心技术：单细胞测序与质谱流式细胞术
单细胞测序主要有四个工作流程：单细胞制备、单细胞分离和文库制备、测序和初级分析、生信分析。单细胞制备通常采用机械法、酶解法或其他组合方案将组织裂解，随后将特定的细胞群富集、标记，成为单细胞样本。单细胞分离与文库制备是单细胞测序的关键步骤，与最终单细胞数据的质量、精准度息息相关。
低通量单细胞分离方法有梯度稀释、口吸移液、自动显微操作、激光捕获显微切割等，但由于一次只能处理一个细胞，日处理量为10个，效率低，成本高，应用有限，本文不多作赘述。
高通量单细胞分离的方法主要为三种，微孔（microwell-）、微液（microfluidic）以及微滴(droplet)，这三种方法都基于微流控原理。
基于微孔的捕获技术可以使用细胞移液器或激光捕获分离细胞，并将他们放置于微液流孔中。相较于另两种方法，细胞通量低，且仅能用于转录组测序，不能应用于其他组学。代表企业包括BD Biosicence、Cell Mircrosystem、Cellsee等。
微液技术是在微米级结构中操纵微小液体的科学技术，将单细胞的培养、制备、反应、分离、检测等步骤集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。相较于微孔，微液技术细胞通量更高，但缺点是，只有10% 的细胞能够被捕获到，代表企业包括Fluidigm。微流控芯片是微流控技术的核心壁垒，基于传统单相的微流控芯片，逐步发展成为微液滴芯片，以微液滴芯片为核心的微流控技术成为微滴，微滴已得到广泛关注和应用，代表企业包括10x Genomics、万乘基因、1Cellbio、Mission Bio、dolomite bio等。
单细胞样品经捕获分离获得活性单细胞，随后将活性单细胞遗传信息扩增，建立测序文库，最后使用Illumina测序系统对单细胞文库进行测序，并进行遗传物质的生信分析。
目前，国内单细胞测序企业大部分集中在高通量单细胞转录组测序设备、试剂、微流控芯片的开发，并积极探索高通量单细胞多组学测序相关技术。
（从上至下依次为Cell Mircosystem基于微孔的产品CellRaft、Fluidigm基于微液的捕获技术C1、10x Genomics微滴系统Chromium）
单细胞蛋白分析采用的质谱流式细胞术(Mass Cytometry)是一种将流式细胞技术与质谱分析技术结合在一起的新技术。
简单来说，就是利用质谱原理、独特的金属标记抗体标记细胞表面和内部蛋白，对单细胞进行多参数检测的流式技术。
它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力，能在单细胞水平同时分析超过50种细胞参数，相较于流式细胞技术常规分析4-10种蛋白，在分析效率上有极大的提升，是流式细胞术一个新的发展方向。
质谱流式采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记或识别细胞表面和内部的信号分子，然后再用感应耦合等离子质谱（ICP-MS）观察单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据，并通过专业分析软件对获得的数据进行分析，从而实现对细胞生物标志物和信号网络的观察与分析。代表企业为Fluidigm和宸安生物。
单细胞测序与蛋白研究中虽然使用不同的核心技术，但本质都是从单细胞水平去探索、发掘基因、蛋白在机体的作用机制，两者各有所侧重，各有优势。单细胞测序核心技术的微流控检测对象为核酸，借助于其高通量地检测能力，在单细胞转录组、基因组、表观组等多组学研究中起着非常关键的作用。
现有技术的条件可以实现同时对1万个细胞进行分析，虽然市面上有许多的基因数据分析软件，但整个建库、测序和数据分析仍然耗时长，单次测序时间至少为两周，测序成本高。
单细胞蛋白分析的核心技术是质谱流式细胞术，检测对象为胞内或者细胞表面蛋白，因此在包括血液系统疾病、肿瘤免疫治疗和免疫系统疾病在内的复杂疾病的诊断领域更具优势，质谱流式细胞术可实现对多达100万的细胞进行50种不同生物标志物分析检测，由于质谱分析壁垒高，针对单细胞的质谱分析软件较少，通常需要企业自行研发，但总体单细胞蛋白分析耗时较短，为1-2小时。
单细胞领域企业一览表：
总的来看，国内单细胞技术领域主要集中在单细胞测序技术平台的研发，构建核心技术壁垒上，专注提供单细胞生信分析服务的企业较少，单细胞蛋白领域较少企业涉足，仍具备一定的市场空间。
应用
单细胞测序技术已经在科研领域得到了广泛应用，最为直接的是用于肿瘤免疫的转化医学研究、伴随诊断和用药指导。包括肿瘤免疫治疗的评估、伴随诊断、疗效评估，肿瘤个性化用药指导，肿瘤及疾病标志物、细胞类群变化鉴定等。
例如，肿瘤新抗原疗法是单细胞测序技术与临床应用进行早期结合的一个应用方向。肿瘤新抗原是一种个体化的治疗方案，每个人的肿瘤细胞都有特异性的抗原，研究人员由此预测新抗原，并进行针对性治疗。
新抗原的存在性和抗原性检测是基于DNA而非基因表达做出的，这就需要结合单细胞测序来确定新抗原的表达强度，从而实现快速筛选。
又如，在液体活检领域，复旦大学生物医学研究院的施奇惠教授研究发现，CTC（循环肿瘤细胞）检测可以用于肿瘤早筛以及肿瘤转移检测，但CTC细胞具有异质性，不同技术路线将捕捉到不同纯度、亚型的CTC，就难以通过检出的CTC来判断肿瘤是否转移。
通过单细胞测序技术可以检测并分辨出极为微量的CTC，有望发掘CTC的临床价值。
单细胞测序在还可以应用于微生物研究，神经科学、免疫学等领域，具体包括：
1、 用于新物种鉴定、病原进化、耐药检测、临床诊断等微生物分析
2、 用于探索神经元细胞亚型及其与阿尔兹海默症、帕金森、精神分裂症、抑郁症等疾病的发作机制等神经科学分析。
3、 精确检测单个免疫细胞的遗传物质，分析单个免疫细胞而非组织群体免疫细胞在免疫机制中的作用等的免疫学领域研究。
单细胞蛋白组学在肿瘤免疫治疗也具有的应用潜力，主要应用包括：
1、 通过检测血液蛋白，寻找癌症早期诊断以及指导分子靶向治疗的生物标志物组合。
2、 探索免疫疗法的细胞通路，作用机制，预测治疗反应。
当然，单细胞蛋白组学的应用并不局限在肿瘤免疫领域，在免疫学、干细胞、疫苗研究等多个领域都已应用于基础研究、药物开发以及转化研究。以下我们将列举单细胞领域企业，了解单细胞多组学在科研、临床的应用以及产业化现状。
10x Genomics
10x Genomics成立于2012年，公司面向全球提供单细胞测序设备，目前已经推出单细胞测序平台GemCode、Chromium。其中，Chromium平台增加了单细胞转录组建库的功能，一次建库测序最多可获得6000个细胞的单细胞转录组数据。10X正在与Agilent合作，共同研发外显子组单细胞测序产品。
2018年，10x 先后收购了表观遗传学公司Epinomics和空间基因组技术公司Spatial Transcriptomics，以此完善其在RNA测序中的能力。2019年9月，10x Genomics在纳斯达克上市，IPO3.9亿美元。
万乘基因
万乘基因成立于2018年，专注于自主研发高通量单细胞测序平台，包括微流控设备、微液滴芯片、多组学试剂、分析软件等，可以单次并行分析一万个细胞。
万乘基因已经完成500万元天使轮融资，除转录组、ATAC外，公司最新研发的产品涵盖了单细胞甲基化、ChlP等表观组学领域。与美国上市单细胞测序公司10x Genomics相比，万乘基因不仅是单细胞测序上游的仪器设备和试剂提供商，还面向终端用户提供系统的单细胞研究解决方案，包括从研究设计，样品制备到生信分析的全套服务。
目前，万乘基因正在与多家免疫相关公司探索单细胞测序技术在抗体开发、TCR筛选、新抗原检测中的应用。
宸安生物
宸安生物成立于2015年，专注于自主研发质谱流式细胞技术平台，实现高通量单细胞蛋白分析。平台包括核心试剂，用于标记细胞蛋白的独特的金属标记抗体，设备仪器，以及质谱数据分析软件。
公司已完成数千万元A+轮融资，不同于国外对标企业Fluidigm的质谱流式平台（初由DVS Sciences研发，后被Fluidigm收购），宸安生物开发的质谱流式技术平台聚焦临床应用。
宸安生物的高效质谱流式细胞技术能够实现单细胞的50种蛋白质表达水平分析，并聚焦于血液系统疾病的诊断和肿瘤免疫疗法的诊断产品开发。
总结
尽管微流控技术、测序技术、质谱流式细胞术的发展实现了在单细胞水平的遗传物质、蛋白分析与检测，并广泛应用于科研领域，但要将其产业化，仍面临不少挑战。
百度风投认为，单细胞检测与分析产业化难点有三处：
1、工程迭代周期长，技术实现到工程稳定再到下游应用分析全链条实现，单细胞多组学分析的质量受单细胞捕获效率、试剂体系、设备通量和精度等条件制约，涉及微流控技术、极微量分析定量、海量生物数据分析等核心技术，对团队综合能力要求极高；
2、单细胞检测成本高，单细胞多组学分析是一个综合系统的工程，从单细胞样品制备、分离捕获，到上机基因测序或蛋白检测，原来一份Bulk样本的检测量变成了一万份单细胞样本，当前的使用成本仍不适合大规模临床采用；
3、数据分析与临床需求结合难度高，单细胞分析将获得更为复杂的基因、蛋白数据，这些数据与临床表型有怎样的关联，如何进行分析，这些都是单细胞生信分析的难点。因此，要将单细胞多组学研究大规模应用，需要从整体水平，各个环节降低成本，克服技术壁垒，并找准单细胞数据与临床的契合点。
合力投资指出，单细胞测序的核心在于测序前处理，其中难点在于如何形成规模效应，及时处理样本，富集测试对象细胞，然后在单细胞水平精准标注、区分不同的细胞，形成单细胞水平、分子水平的标签，这对样本处理来说是极大的挑战。
此外，单细胞水平数据分析与细胞团层面的数据分析相比，数据维度更高，每个单细胞数据都将可能成为数据分析的新的维度，这也让单细胞测序数据分析难以有所突破。
在产业化方面，单细胞测序有两个极具前景的产业化机遇，一是单细胞测序仪器的设计和开发，这一点，10x Genomics就是典型；另一个是临床的应用，即通过不断的升级迭代，降低单细胞测序费用的成本，让单细胞测序价格达到临床可接受或可支付的水平，最终在临床得到大规模应用。
从2009年到2019年，经过十余年的发展，随着基因测序成本降低，微流控、质谱流式细胞术等核心技术取得突破，基于单细胞水平的遗传物质、蛋白分析已广泛应用于免疫、微生物研究，神经科学等科研领域。
但单细胞分析囿于成本高、门槛高、分析难并未达到大规模应用的程度，目前更多用于攻克肿瘤、免疫等疾病领域的难题。单细胞领域企业适才起步，在多组学分析中大多集中在转录组、蛋白组领域。
可以预测的是，随着10x Genomics的上市，单细胞多组学研究的深入，基因测序成本进一步降低，基于单细胞水平的测序、蛋白分析极具发展潜力，为人们认识疾病、理解免疫机制、药物发现等提供新的视角与方案。
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